ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ НАУЧНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ

Влияние Гепалона и Адгелона
на перекисное окисление липидов
и монооксигеназное окисление в
эндоплазматическом ретикулуме печени крыс

© 2000 г. С. В. Котелевцев, В. П. Ямскова*, И. А. Ямсков**, Ф. Ф. Нагдалиев, В. Труаре

Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
*Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
**Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

Два адгезивных белка из печени и сыворотки крови крыс - гепалон (ГП) и адгелон (СГ) - испытывали на их роль в регуляции перекисного окисления липидов мембран эндоплазматического ретикулума печени в норме и после введения крысам четыреххлористого углеводорода. Параллельно изучали влияние этих препаратов на систему монооксигеназного окисления в печени чужеродных соединений.

Экспериментальные животные - крысы-самцы линии Spred Doly весом 100-120 г были получены из Института молекулярной генетики РАН. Животных содержали на стандартной диете в течение семидневной адаптации и в ходе всего эксперимента. Группы содержали по пять крыс, за исключением тех, которым вводили метилхолантрен (в этих группах было по три или четыре крысы).

Первая группа (I), контрольная: животным вводили по 1 мл стерильного физиологического раствора. Второй группе (II) вводили CCl4 (по 0.2 мл 40%-ного раствора в стерильном оливковом масле на крысу). Третьей группе (III) вводили ГП (по 2 мл на крысу, концентрация белка 10-14 М). Четвертой группе (IV) животных ГП вводили через 1 ч после введения крысам раствора ССl4. Пятой (V) группе крыс вводили метилхолантрен (MX) по 1 мл раствора в оливковом масле из расчета 80 мг на 1 кг веса животного. Шестой группе (VI) вводили MX через 1 ч после инъекции ГП. СГ испытывали по той же схеме, что и ГП.

Микросомную фракцию выделяли индивидуально из печени каждой крысы. Так как выделение микросом из второй группы крыс происходило отдельно, все контрольные группы (всего шесть групп - VII-XII) были взяты повторно. Животных забивали через 48 ч после инъекции.

Выделение микросомной фракции проводили по описанному ранее методу (Котелевцев и др., 1986). Для этого крыс декапитировали и при температуре 40°С перфузировали печень 1.15%-ным раствором КСl, содержащим 2 мг/л фенилметилсульфонилфторида для ингибирования протеаз и 15 мг/л сывороточного альбумина, очищенного от жирных кислот. Печень гомогенизировали на льду в 10-кратном объеме того же раствора с добавлением 10 мМ трис-НС1-буфера с помощью гомогенизатора типа "Политрон".

Гомогенат центрифугировали в настольной центрифуге ("Sigma", США) при следующих условиях: 30 мин, 9000 g, 40°C; супернатант центрифугировали в течение 1 ч (100000 g, 40°C) в центрифуге "Becman LB-50 М/Е". Микросомную фракцию хранили при температуре -70°С. Фракцию ресуспендировали в 50 мМ mpuc-HCl-буфере, содержание белка определяли с помощью биуретова реактива (Gornall et al., 1949).

Концентрацию цитохромов Р-450 и Р-420 определяли по методу Омура и Сато (Omura, Sato, 1964) в присутствии дитионита натрия и СО на спектрофотометре "Shimadzu MPS 50L". При расчете концентраций использовали коэффициенты экстинкции: Р-450 - 91·103 М-1см-1, Р-420 - 11·103 М-1см-1.

Определение в микросомах монооксигеназных активностей: O-деалкилирования 7-этоксирезоруфина (EROD) и этоксикумарина (ECOD) осуществляли с помощью флуоресцентного анализа по известному методу (Ullrich, Weber, 1972; Prough et al., 1978).

Активность ферментативного и неферментативного перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли по образованию малонового диальдегида (МДА) - реакция с тиобарбитуровой кислотой (Kohn et al., 1944).

Растворы инкубации содержали следующее. При ферментативном ПОЛ: НАДФ(Н) - 0.5 мМ; FeS04 - 10 мкМ; NaCl - 50 мМ; трис-НС1-буфер -50 мМ (рН 7.4; t = 37.0°C); при неферментативном ПОЛ: аскорбиновая кислота - 0.25 мМ; FeS04 - 5 мкМ; NaCl - 50 мМ; mpuc-HCl-буфер - 50 мМ (рН 7.4; t = 37.0°С).

Реакцию останавливали добавлением к 1 мл отобранной среды инкубации 1 мл 30%-ной трихлоруксусной кислоты. Затем к смеси добавляли 1 мл 0.67%-ного раствора тиобарбитуровой кислоты и для развития окраски инкубировали пробирки на водяной бане при 90°С в течение 25 мин. Осадок удаляли центрифугированием (20 мин, 600 g) и в супернатанте определяли концентрацию МДА по sD 600-535 нм, исходя из коэффициента молярной экстинкции комплекса 1.56·105 М-1см-1.

Инкубацию проводили при 37°С в течение 15 мин, отбор проб осуществляли через каждые 3 мин. Концентрация белка в инкубационной среде составляла 1 мг в мл.

Одноразовая инъекция четыреххлористого углерода, как это было показано и ранее (Владимиров, Арчаков, 1972), существенно увеличивает уровень малонового диальдегида в микросомной фракции печени по сравнению с контролем. Это свидетельствует об интенсификации перекисного окисления в эндоплазматическом ретикулуме печени крыс, подвергшихся воздействию четыреххлористого углеводорода. Введение крысам MX, наоборот, приводит к снижению уровня ПОЛ. В этот период происходит индукция монооксигеназной системы, что сопровождается снижением скорости образования перекисей в мембранных фосфолипидах печени (Каган и др., 1974).

Введение ГП за 1 ч до инъекции CCl4 приводит к защите микросом печени от развивающегося ПОЛ, однако это снижение недостоверно (с 2.13 ± 0.43 до 1.99 ± 0.36 нмоль МДА на мг белка микросомной фракции печени, р > 0.05).

При этом, однако, достоверно увеличивается скорость ферментативного ПОЛ в группе III по сравнению с группой II. Начальный уровень концентрации МДА и скорость ферментативного ПОЛ в группе III такая же, как и в контроле. Достоверных различий в неферментативном ПОЛ в группах I-III не обнаружено. Это позволяет предположить, что инъекция ГП, во-первых, не влияет на уровень ПОЛ в норме, а во-вторых, защищает мембраны от действия четыреххлористого углерода.

Выдвинутое предположение подтверждается тем, что в группе III по сравнению с группой II достоверно увеличена скорость монооксигеназного окисления как ECOD, так и EROD (для ECOD с 46 ± 4.3 до 66 ± 9.9 нмоль на мг микросомного белка в мин, р < 0.05).

Достоверного влияния ГП ни на индукцию монооксигеназного окисления, ни на модификацию индукции монооксигеназ MX не обнаружено.

Таким образом, ГП является биорегулятором, обладающим антиоксидантным действием и предохраняющим мембраны эндоплазматического ретикулума печени от ПОЛ, вызываемого четыреххлористым углеродом.

Несмотря на то что в ряде случаев действие СГ сохраняло ту же тенденцию, ни на один из исследованных параметров его влияние не было достоверно. Однако его предварительное введение достоверно снижало уровень неферментативного ПОЛ в группе крыс, индуцированных MX (р < 0.05). Ввиду того, что в этих группах было только по четыре животных и данный эффект не наблюдался при испытании ГП, полученный результат требует дополнительной проверки. По-видимому, регуляторное действие СГ в данных концентрациях проявляется слабее, чем ГП, и для его выявления необходимо или увеличить концентрацию с целью усиления эффекта, или провести испытание на большем количестве животных.

Назад